ELISA試劑盒酶聯(lián)免疫法基本原理及注意事項(xiàng)

ELISA試劑盒酶聯(lián)免疫法留神事項(xiàng)：
⒈ 正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)別離以陽性對(duì)照與陰性對(duì)照操控試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證試驗(yàn)效果的性。有時(shí)本底較高，說明有非特異性反響，可選用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
⒉ 在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)條件的挑選是很首要的，其間包含：
⑴ 固相載體的挑選：很多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其辦法可所以凹孔平板、試管、珠粒等。當(dāng)時(shí)常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不論何種載體，在運(yùn)用前均可進(jìn)行挑選：用等量抗原包被，在同一試驗(yàn)條件下進(jìn)行反響，查詢其顯色反響是不是均一性，據(jù)此判明其吸附功能是不是超卓。
⑵ 包被抗體（或抗原）的挑選：將抗體（或抗原）吸附在固相載體外表時(shí)，央求純度要好，吸附時(shí)一般央求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)刻及其蛋白量也有必定影響，一般多選用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不一樣的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相一同，查詢陽性標(biāo)本的OD值。挑選OD值z(mì)ui大而蛋白量zui少的濃度。對(duì)于大都蛋白質(zhì)來說一般為1～10μg/ml。
⑶ ⑷ 酶的底物及供氫體的挑選：對(duì)供氫體的挑選央求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反響，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌效果，應(yīng)留神防護(hù)。有條件者應(yīng)運(yùn)用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是當(dāng)時(shí)較為滿意的供氫體。底物效果一段時(shí)刻后，應(yīng)參加強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以間斷反響。一般底物效果時(shí)刻，以10-30分鐘為宜。底物運(yùn)用液有必要新鮮制造，尤其是H2O2在臨用前參加。①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體外表，并堅(jiān)持其免疫活性。
②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)守時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其間的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不一樣的進(jìn)程與固相載體外表的抗原或抗體起反響。用洗刷的辦法使固相載體上構(gòu)成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分隔，終究結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成必定的份額。參加酶反響的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩唐罚唐返牧颗c標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接有關(guān)，故可根據(jù)色彩反響的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。因?yàn)槊傅拇呋l率很高，故可很大地拓展反響效果，從而使測(cè)定辦法抵達(dá)很高的敏感度。
ELISA試劑盒可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定辦法中有3種必要的試劑：
①固相的抗原或抗體
②酶符號(hào)的抗原或抗體
③酶效果的底物。根據(jù)試劑的來歷和標(biāo)本的性狀以及檢查的具備條件，可規(guī)劃出各種不一樣類型的檢查辦法。