人胚胎生殖細胞體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化及細胞移植實驗方法

1.1   主要試劑   DMEM培養(yǎng)基 （GIBCO/BRL 、高糖）、胎牛血清（fetal calf serum , FCS , Hyclone）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF , R&D公司）、白血病抑制因子（LIF，R&D公司）、培養(yǎng)液A：DMEM液（高糖）+15%胎牛血清+0.1 mol/Lβ-巰基乙醇+2 mmol/L谷氨酰胺+100 U/ml青霉素+100 U/L 鏈霉素、培養(yǎng)液B：DMEM液（高糖）+15%胎牛血清+0.1 mol/Lβ-巰基乙醇+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 U/ml青霉素+100 U/L 鏈霉素 +1000 U/ml hLIF +1 ng/ml bFGF[30]、胰蛋白酶（Sigma）及EDTA、MAB-1281（小鼠抗人細胞核單克隆抗體，CHEMICHON）、正常山羊血清 （博士德公司）、EnVision檢測試劑盒（GK500705，Gene Tech, 盒中包括通用型二抗，DAB及稀釋液）。

    1.2   胚胎來源   收集蘇州大學附屬第二 醫(yī)院 婦產(chǎn)科，蘇州市婦幼保健中心人工中止妊娠的5~10周人胚，每例胚胎均經(jīng)孕婦和道義委員會同意，胚胎需完整，無嚴重污染。

    1.3   人EG細胞的原代培養(yǎng)   取5~10周流產(chǎn)胚胎，在流產(chǎn)后6 h內(nèi)，于超凈工作臺內(nèi)，用含雙抗（400 U/ml青霉素、400 U/ml鏈霉素）的無Ca2+、Mg2+的PBS沖洗胚胎，將胚胎移入無菌培養(yǎng)皿，打開胚體體腔，去除內(nèi)臟，將背側腸系膜及兩邊的生殖嵴從胚體背側撕下，用含高濃度雙抗的無菌PBS沖洗組織塊數(shù)次，將取出的組織切成1 mm3左右的小塊。將切碎的組織塊移入4個培養(yǎng)瓶內(nèi)，兩瓶滴加少量培養(yǎng)液A， 兩瓶滴加少量培養(yǎng)液B。于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，24 h后加入足量培養(yǎng)液。以后每2天半量換液，每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)。

    1.4   人EG細胞的傳代培養(yǎng)   挑選細胞已鋪滿瓶底的培養(yǎng)瓶，棄去瓶內(nèi)培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液1~2 ml消化細胞，2~4 min后，鏡下觀察，當人EG細胞集落開始分散形成由數(shù)個細胞組成的細胞團時，加入3 ml與原培養(yǎng)液相同的A或B培養(yǎng)液終止消化。用吹管將細胞吹打成單細胞懸液，吸出一半移入另一個培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，次日換液。追蹤觀察傳代細胞的生長狀況。

    1.5   移植細胞的制備   移植前1 h，以無菌接種針挑取傳代培養(yǎng)至第4代人EG細胞集落，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化[3]，待細胞發(fā)生胞質回縮，細胞集落分散開時，即加含血清培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復輕輕吹打瓶底，使細胞成為均勻的單細胞懸液，用無菌PBS離心洗滌2次，將細胞吹打均勻，計數(shù)板計數(shù)，調密度至1×106／ml。以微量注射器吸取50 μl，置4 ℃待用。

    1.6   實驗動物分組及心肌梗死模型制作   將體重200~250 g SD大鼠40只隨機分為2組：（1）急性心肌梗死+人EG細胞（AMI+hEGcs, n=28）;大鼠心肌梗死后在梗死區(qū)邊緣分四點注射各點注入12 μl細胞懸液；（2）急性心肌梗死對照組（AMI+PBS，n=12）：大鼠心肌梗死后在梗死區(qū)邊緣分4點注射各點注入12 μl PBS。具體步驟參照 文獻 [4]。建模成功后即在心肌梗死區(qū)邊緣用微量注射器分4點注射，各點注入12 μl人EG細胞懸液，密度為1×106／ml，對照組以同樣方法注入等量的無菌PBS。關胸，維持輔助呼吸至自主呼吸恢復，送回籠中飼養(yǎng)。術后肌肉注射青霉索40 U以預防感染，并在30 ℃條件下蘇醒。全手術過程為無菌操作，術后不需拆線。

    1.7   免疫組織化學法鑒定   移植后1 d、1、2、4周，分別取7只移植組和3只對照組大鼠，用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，取出心，PBS沖洗血液，去除左右心房和右心室，將左心室部位用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，石蠟切片采用二步法進行免疫組織化學標記，一抗分別為鼠抗人細胞核單抗（1∶100，MAB1281），二抗為通用型二抗，顯微鏡下觀察。實驗嚴格按照說明書進行操作。